产品目录

本试剂盒适用于从革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌中提取高纯度总DNA，每次可处理10⁶～10⁸个细胞，获得多至20μg的总DNA。纯化过程中不需苯酚或氯仿等有毒溶剂，无需乙醇沉淀，一小时内即可获得高纯度DNA。本试剂盒采用优化的缓冲体系使裂解液中的DNA高效特异的结合到硅基质离心吸附柱上，而其他污染物可流过膜，PCR和其他酶促反应的抑制剂可通过两步洗涤步骤被有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗脱，即可获得高纯度DNA。纯化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文库构建、Southern Blot、分子标记等下游实验。

• 无水乙醇；
  
• 提取革兰氏阳性菌需自备Enzymatic Lysis Buffer。
  配制方法：20mM Tris，pH8.0；2mM Na2-EDTA，pH8.0；1.2% TritonX-100。121℃灭菌处理20分钟，加入适量的Lysozyme（溶菌酶）其终浓度为20mg/mL。

• 向Proteinase K中加入1.25mL Proteinase K Storage Buffer使其溶解，-20℃保存。配制好的Proteinase K勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
  
• 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。
  
• 如果提取次生代谢产物大量积累或细胞壁厚的细菌培养物的基因组，建议在对数生长期早期收集样品。
  
• 第一次使用前在13mL Buffer GW1中加入17mL无水乙醇，15mL Buffer GW2中加入35mL无水乙醇。
  
• 使用前请检查Buffer GTL和Buffer GL是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀出现，请将Buffer GL和Buffer GTL于56℃水浴重新溶解。
  
• 如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在加入Buffer GL前加入4μL DNase-Free的RNase A（100mg/mL），RNase A本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购RNase A溶液(100mg/mL)(货号：WE0225)。
  
• 如果提取样品为革兰氏阳性菌，需客户自行配制Enzymatic Lysis Buffer处理菌体，其中需使用浓度为20mg/mL的Lysozyme(溶菌酶)，Lysozyme本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购溶菌酶(货号：WE0214)。

• 革兰氏阴性菌基因组DNA的提取
  
  • 取细菌培养物1～5mL（10⁶～10⁸个细胞，最多不超过2×10⁹个细胞）置于离心管（自备）中，12000rpm（~13400×g）离心1分钟，尽量吸净上清。
    
  • 向沉淀中加入180μL Buffer GTL，振荡使菌体重悬。
    
  • 加入20μL Proteinase K，涡旋混匀，56℃孵育，直至溶液变清亮，孵育过程中每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样本分散。
    注意：如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μL浓度为100mg/mL的RNase A溶液(100mg/mL)(货号：WE0225)，震荡混匀，室温放置5～10分钟。
    
  • 加入200μL Buffer GL，涡旋震荡充分混匀。加200μL无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
    注意：
    
    • 如果多个样品一起操作，Buffer GL和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入，震荡混匀。
      
    • 加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。
  • 将步骤4所得溶液（包括形成的沉淀）全部加入到已装入收集管的吸附柱DM中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
    
  • 向吸附柱中加入500μL Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
    
  • 向吸附柱中加入500μL Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
    注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7。
    
  • 12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
    注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR等）。
    
  • 将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50～200μL Buffer GE，室温放置2～5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
    注意：
    
    • 如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0～8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。
      
    • 离心之前室温孵育5分钟可以增加产量。
      
    • 用另外的50～200μL Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
      
    • 如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤9所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤9；若洗脱体积小于200μL，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg，推荐用50μL Buffer GE或灭菌水洗脱。
      
    • 保存在水中的DNA会受到酸性水解作用影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。
• 革兰氏阳性菌基因组DNA的提取
  
  • 取细菌培养物1～5mL（10⁶～10⁸个细胞，最多不超过2×10⁹个细胞）置于离心管（自备）中，12000rpm（~13400×g）离心1分钟，尽量吸净上清。
    
  • 加入180μL Enzymatic Lysis Buffer（自备）使菌体重悬。Enzymatic Lysis Buffer配制方法见说明书前部分自备试剂。
    
  • 37℃孵育30分钟。
    
  • 加入20μL Proteinase K涡旋震荡，充分混匀。加入200μL Buffer GL，涡旋震荡混匀。
    注意：不要把Proteinase K直接加到Buffer GL中。
    
  • 56℃孵育30分钟。
    注意：
    
    • 如果需要，95℃孵育15分钟可以使病原体失活，但是95℃孵育会造成一些DNA的降解。
      
    • 如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μL浓度为100mg/mL的RNase A溶液(货号：WE0225)，震荡混匀，室温放置5～10分钟。
  • 加入200μL无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。
    注意：加入无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。
    
  • 将步骤6所得溶液（包括形成的沉淀）全部加入到已装入收集管的吸附柱DM，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
    
  • 向吸附柱中加入500μL Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
    
  • 向吸附柱中加入500μL Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
    注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤9。
    
  • 12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟彻底晾干。
    注意：这一步目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR等）。
    
  • 将吸附柱置于一个新离心管（自备）中，向吸附柱中间部位悬空加入50～200μL Buffer GE，室温放置2～5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
    注意：
    
    • 如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0～8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。
      
    • 离心之前室温孵育5分钟可以增加产量。
      
    • 用另外的50～200μL Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
      
    • 如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤11所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤11；
      若洗脱体积小于200μL，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg，推荐用50μL Buffer GE或灭菌水洗脱。
      
    • 保存在水中的DNA会受到酸性水解作用影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。